Gimdos kaklelio ikivėžinės patologijos prognostinių veiksnių tyrimas panaudojant biolustų metodikas

Projekto pavadinimas
 
Projekto įgyvendinimo terminai
2007 03 mėn. - 2009 12 31
Finansavimas
Projektas finansuojamas iš Lietuvos valstybinio mokslo ir studijų fondo lėšų, iš Mokslininkų grupių rėmimo programos. Bendra projekto vertė 36 000 Lt. Valstybiniam patologijos centrui skirta 28 000 Lt.
Pareiškėjas
Valstybinis patologijos centras
Partneriai
Fizikos institutas
Įgyvendinantis personalas
Prof. dr. Arvydas Laurinavičius, dokt. Rūta Kurtinaitienė, dokt. Jolita Rimienė.
Daugiau informacijos teirautis
Projektų vadybininkas Justinas Baužys, Justinas.Bauzys@vpc.lt, mob. tel. 8 656 12874.
Rezultatai:
Projekto išvados:
 
1.Eksperimentais buvo įsitikinta, kad pati biolustų konstravimo strategija gali būti realizuota naudojant kitą paviršiaus struktūrizavimo metodą - pjezoelektrinį mikrodispensavimą, kuomet tiolių molekulės tirpalas mikrolašelių pavidalu išdozuojamas ant Au paviršiaus. Elektroforezė patvirtino p16 baltymo buvimą ekstraląsteliniame skystyje, jei p16 buvo teigiamas ir ląstelėje.
 
2. PAPSPINTM terpės gali būti netinkamos baltymų nustatymui biolustu metodu, nes jos yra pagamintos spiritiniu pagrindu ir baltymai denatūruojami, todėl galimos diagnostikos klaidos.
 
Kiti rezultatai:
 
Šio projekto metu surinkta 136 citologinių mėginių į skystą PAPSPINTM terpę. Mėginiai centrifuguoti ir paruošta vienasluoksnių citologinių tepinėlių. Tepinėliai buvo vertinami citologo pagal Bethesda sistemą. Vienasluoksnis citologinis tepinėlis, kurio citologinė diagnozė HSIL buvo dažomas p16INK4a įsitikinti, kad šis baltymas yra ląstelėje. Virš nuosėdinis skystis – supernatantas - buvo mūsų tiriamas objektas. Supernatantas, kurių vienasluoksniame citologiniame tepinėlyje buvo teigiamas p16, t.y. ląstelėje nustatytas p16, šie supernatantai papildomai tiriami atliekant elektroforezę, Western blot ir SPR (surface plasmode resonance). Elektroforezę atlikta tikslu įsitikinti ar ekstraląsteliniame skystyje randamas p16 baltymas. Mėginiai, kuriuose elektroforezė pagal molekulinę masę nustatė šio baltymo buvimą, papildomai tirti atliekant SPR ir Western blotą, taip pat bandoma juos nustatyti ir mikrogarelių (biolustų) metodu.
 
Eksperimente dalyvaujančioms pacientėms buvo atlikti citologiniai, histologiniai, baltymo p16INK4a imunohistocheminiai tyrimai ir ŽPV testai tam, kad būtų gauta aiški ligos diagnozė, o moteris priskirta sergančių ar sveikų grupei. Tuomet gauti duomenys buvo lyginami su mikrolustų eksperimento rezultatais.
Projekto tikslai ir uždaviniai:
1. Identifikuoti ligos atvejus moterų, kurios buvo nukreiptos į VUOI dėl gimdos kaklelio patologijos gydymo, papildomai atlikti skystų terpių tepinėlio tyrimą, paruošti supernatantą spektrofotometriniam tyrimui bei ŽPV infekcijos nustatymui, o iš biopsinės medžiagos įvertinti baltymo p16 raišką.
2. Pirminiame asmens sveikatos priežiūros centre atrinkti kontrolinius studijos atvejus iš moterų, apsilankiusių dėl profilaktinės gimdos kaklelio patologijos patikros (amžius +3 metai lyginant su ligos atvejais), atlikti skystų terpių tepinėlio tyrimą ir paruošti supernatantą spektroskopiniam tyrimui bei ŽPV infekcijos nustatymui.
3. Atlikti supernatantų spektrofotometrinius tyrimus, jų rezultatus vizualizuojant trijų matmenų (3D) matematinės analizės metodu, įvertinant žadinimą, fluorescenciją bei atsako intensyvumą.
4. Sugretinti skystų terpių bei spektrofotometrinio tyrimo (3D) duomenis moterims supatologija ir be jos atvejo ir kontrolės tyrimo metodo pagalba, atsižvelgiant į įtakojančius veiksnius, kaip p16 raišką bei ŽPV infekciją bei įvertinti spektroskopinio tyrimo jautrumą ir specifiškumą.
Projekto aprašymas ir veiklos:
Sergamumas ir mirtingumas nuo gimdos kaklelio vėžio Lietuvoje didėja nuo 1992 metų ir pastaruoju laiku viršija Europos vidurkį.2005 metais buvo užregistruoti 500 naujų gimdos kaklelio vėžio atvejų, o tais pačiais metais dėl šio piktybinio naviko mirė 236 moterys[1]. Nuo 2004 metų vidurio pradėta valstybinė gimdos kaklelio patologijos patikros programa, kurios tikslas - sumažinti mirtingumą nuo gimdos kaklelio vėžio. Tai gali būti pasiekta gerinant ankstyvą diagnostiką bei efektyviau išaiškinant gimdos kaklelio patologijos ikivėžines būkles – Ca in situ atvejus. Lietuvoje pradėta gimdos kaklelio patikros programa 2005 m. leido išaiškinti 591 naujus Ca insitu atvejus. Daugiau nei 50 metų gimdos kaklelio organizuotos patikrosmetu visame pasaulyje yra taikoma Papanicolaou (PAP) tepinėlio paėmimas nuo gimdos kaklelio kas 3-5 metai. Taip nustatoma epitelio ląstelių pakitimai. Jei Pap tepinėlis rodo patologiją, reikalaujama atlikti kolposkopiją ir pakitusios gimdos kaklelio srities biopsiją. Deja, šios patikros priemonės yra riboto jautrumo ir specifiškumo: Pap tyrimo jautrumo ribos svyruoja nuo 30 iki 80proc., o specifiškumo - nuo 86 iki100 proc. Tai skatina ieškoti naujų tyrimo metodų, kurie būtų jautresni ir specifiški šios patologijos išaiškinimui. Tada būtų galima pagerinti ankstyvą ikivėžinių gimdos kaklelio susirgimų diagnostiką, o tai leistų žymiai sumažinti susirgimų ir mirčių nuo gimdos kaklelio vėžio skaičių.
Tokių metodų kūrimui pasitarnavo 1996 metais JAV maisto ir vaistų kontrolės tarnybos patvirtintas naujas, vienasluoksnis citologinis gimdos kaklelio tepinėlis, kuriam gauti naudojama skysta fiksuojanti terpė su joje pasklidusiomis ląstelėmis. Šiuo būdu pagaminti tepinėliai gerokai kokybiškesni ir geriau tinka mikroskopiniam tyrimui nei įprastiniai Pap tepinėliai. Įvairių šaltinių duomenimis, skystų terpių citologija yra jautresnė už Pap tepinėlį nuo 2,8 iki12 proc[2]. Vienas pagrindinių terpės privalumų - ŽPV (žmogaus papilomos viruso) nustatymas. ŽPV yra vienas svarbiausių faktorių gimdos kaklelio karcinogenezėje ir būtinas veiksnys gimdos kaklelio neoplazijai. Lytiniu keliu plintantis ŽPV, kai kurie onkogeniniai jo tipai sukelia epitelinių ląstelių pokyčius, iš kurių gali išsivystyti vėžys. Dažniausiai gimdos kaklelio vėžį indukuoja didelės rizikos 16 ir 18 tipo virusai. Gimdos kaklelio epiteliniai navikai daugiau susiję su 16 tipo virusu, gimdos kaklelio endocervikinė adenokarcinoma - su 18 tipo ŽPV. Piktybinei gimdos kaklelio ląstelių transformacijai labai svarbūs viruso genų E6 ir E7 koduojami produktai, kurie sutrikdo pažeistos ląstelės dalijimosi ciklą-padidina p53 irRb baltymų degradaciją[3],[4],[5]. Šis procesas aktyvuoja ydingą kitų veiksmų ciklą, dėl ko pasireiškia stipri, nuo ciklinazių priklausančių kinazių inhibitorių, p16INK4a superekspresija. Į šį markerį žiūrima su didele viltimi, kadangi jis nurodo, ar yra ląstelėje onkogeninis ŽPV, ir ar pakenkta ląstelės funkcija. Iki šiol atliktos studijos siūlo p16INK4a gimdos kaklelio histologijos imunohistocheminį tyrimą moterims, kurioms norima patvirtinti ŽPV, esant CIN 1 (CervicalIntraepitel Neoplasia) ar didesniems gimdos kaklelio epitelio intraepiteliniams pakenkimams[6]. Tikimasi, kad šis žymuo galėtų būti ateities biomarkeris, diagnozuojant gimdos kaklelio ikivėžinius susirgimus.
Vykdant šį projektą buvo siekiama sukurti eksperimentines greitesnes ir patikimesnes metodikas ŽPV sukeltų gimdos kaklelio ląstelių ikivėžinių pakitimų identifikavimui skystų terpių citologiniuose mėginiuose, panaudojant naujausias biolustų (mikrogardelių) technologijas. Naudojant šias technologijas, bus sukurtos integruotos cheminės mikrostruktūros kietuose paviršiuose. Jos galės registruoti viruso RNR, kapsidės baltymus, jo inicijuotus onkogenus, taip pat ląstelės cikloreguliatorių p16. Nustatyti pastarąjį baltymą klinikiniais tyrimais paprastai naudojami imunocheminiai rinkiniai, tačiau jie yra brangūs ir užima santykinai daug laiko. Nauja eksperimentinė platforma leistų lygiagrečiai ir kompleksiškai tirti ŽPV, infekcijos integracijos ir ląstelės genomo pakenkimo laipsnį, jo produktų sąveiką su ląstelėmis daugelyje pacienčių vienu metu.